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熒光成像為生命科學(xué)研究帶來了無限可能，從寬場(chǎng)熒光到共聚焦，再到超分辨，我們觀察的精度不斷提升，但一個(gè)問題始終存在——熒光淬滅。今天我們來看看《自然》雜志的工具論文，“走向更亮更耐光的熒光團(tuán)"，了解下更耐光的熒光團(tuán)是怎么煉成的。

一、熒光淬滅是什么？

先定義下熒光淬滅。熒光淬滅或者通俗點(diǎn)叫“褪色"，泛指降低熒光團(tuán)熒光強(qiáng)度的所有過程。

①大致可以分為四種：

1、化合物形成complex formation

化合物形成淬滅

熒光物質(zhì)分子與外部分子/離子反應(yīng)形成非熒光化合物，常見的熒光淬滅就是高光強(qiáng)下氧化形成新的化合物，這種現(xiàn)象也叫光漂白photo bleaching，是不可逆的破壞。

2、能量轉(zhuǎn)移energy transfer

FRET：藍(lán)熒光轉(zhuǎn)移成黃熒光

顧名思義，能量出現(xiàn)了從供體到受體的轉(zhuǎn)移，如果受體不產(chǎn)生熒光，那熒光就熄滅了；如果受體產(chǎn)生熒光，就會(huì)出現(xiàn)受體熒光和次級(jí)熒光光譜紅移，這就是熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET.

3、激發(fā)態(tài)反應(yīng)excited state reactions

ESIPT激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移②

激發(fā)態(tài)高能量下熒光團(tuán)化學(xué)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)破壞，改變熒光特性，這種現(xiàn)象稱為激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移ESIPT，可以理解為2的質(zhì)子轉(zhuǎn)移版本。

4、濃度淬滅collisional quenching

聚集誘導(dǎo)淬滅ACQ和聚集誘導(dǎo)熒光AIE③

熒光分子聚集或距離過近導(dǎo)致互相干擾，非輻射衰減概率增大，使發(fā)光效率下降，這種現(xiàn)象稱為聚集誘導(dǎo)淬滅ACQ。有些熒光團(tuán)反過來，是在聚集態(tài)才會(huì)增強(qiáng)熒光，這種現(xiàn)象就是聚集誘導(dǎo)熒光發(fā)光AIE.

二、三種改造熒光團(tuán)的嘗試④

熒光發(fā)光原理⑤

熒光團(tuán)在激發(fā)態(tài)回到正常態(tài)需要釋放能量，要么發(fā)出熒光釋放，要么以震動(dòng)等形式非輻射衰減釋放。理論上，減少非輻射衰減的比例，就能提升熒光釋放比例，以此獲得更高光強(qiáng)、更長(zhǎng)的熒光壽命。

1、加固蛋白結(jié)構(gòu)的mCherry

mCherry的結(jié)構(gòu)渲染圖，外層螺旋是β-桶結(jié)構(gòu)

通過改變熒光蛋白的蛋白支架結(jié)構(gòu)，使其更穩(wěn)定，從而提升熒光強(qiáng)度，延長(zhǎng)熒光壽命，比如“加固"mCherry的β-桶結(jié)構(gòu)，防止發(fā)色團(tuán)的分子重排，可以減少非輻射衰減，得到的mCherry-XL 和 mScarlet3 都比mCherry更亮更耐光。

mScarlet3亮度是mCherry 5倍左右，壽命3倍以上

2、關(guān)閉非輻射衰減的EGFP

EGFP標(biāo)記的斑馬魚，MZX81拍攝

通過模擬計(jì)算，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)EGFP存在的一個(gè)非輻射途徑是電子從發(fā)色團(tuán)轉(zhuǎn)移到酪氨酸殘基上，從而改變了熒光特性。把酪氨酸換成亮氨酸，可以阻斷這個(gè)非輻射途徑，成功將EGFP的耐光性提升80倍。可惜這種EGFP的亮度受到了負(fù)面影響，變暗了，因此在生物領(lǐng)域可能用不上。

3、改良工藝的羅丹明系列染料

Janelia Fluor對(duì)比傳統(tǒng)染料

羅丹明是Texas Red、ROX、TAMRA等染料的基礎(chǔ)成分，傳統(tǒng)合成工藝在試劑環(huán)境、精度控制等方面存在局限，有科學(xué)家成功以更現(xiàn)代化的合成工藝對(duì)其進(jìn)行改良，在烷基氨基取代基中引入氘原子，改變了關(guān)鍵分子尺寸，從而減少了非輻射衰減。這形成的就是Janelia Fluor系列熒光染料，覆蓋從綠色到紅色熒光光譜，可以提供幾倍于傳統(tǒng)熒光染料的熒光光強(qiáng)和熒光壽命。

三、如何更好地使用這些改良的熒光團(tuán)？

mCherry-XL激發(fā)峰在Y波段

熒光團(tuán)改良后，不僅熒光強(qiáng)度更高、熒光壽命更長(zhǎng)，其激發(fā)發(fā)射屬性也可能發(fā)生變化。比如mCherry-XL和mScarlet3，它們需要使用Y通道激發(fā)，而不是原版mCherry的R通道激發(fā)。

MF43-N可升級(jí)Y激發(fā)塊支持mCherry-XL和mScarlet3

MF43-N和MF53-N可以通過安裝Y激發(fā)塊/G2激發(fā)塊支持mCherry-XL和mScarlet3，而其他顯微鏡可以選擇帶Y通道的數(shù)顯熒光模塊實(shí)現(xiàn)支持。

更亮更耐光的熒光團(tuán)更適合dSTORM超分辨成像

但這些更亮更耐光的熒光團(tuán)更大價(jià)值在于適用于更高要求的成像，比如共聚焦和超分辨熒光成像。使用MF53-TIRF升級(jí)成dSTORM成像時(shí)，需要搭配高亮度、高耐光的熒光染料，才能獲得更高信噪比的成像。而在一些神經(jīng)學(xué)實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)有科學(xué)家利用這些新型染料，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腦神經(jīng)毫秒級(jí)的電信號(hào)變化進(jìn)行熒光標(biāo)記成像，從而更深入揭示神經(jīng)元信息處理和學(xué)習(xí)的機(jī)制。

①Lakowicz, J.R. (1983). Quenching of Fluorescence. In: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Springer, Boston, MA. https://doi.org/10.1007/978-1-4615-7658-7_9

②Pivovarenko, Vasyl. (2023). Multi-Parametric Sensing by Multi-Channel Molecular Fluorescent Probes Based on Excited State Intramolecular Proton Transfer and Charge Transfer Processes. BBA Advances. 3. 100094. 10.1016/j.bbadva.2023.100094.

③Dongdong Li, Yuping Zhang, Zhiying Fan, Jie Chen and Jihong Yu, Coupling of chromophores with exactly opposite luminescence behaviours in mesostructured organosilicas for high-efficiency multicolour emission,DOI: 10.1039/C5SC02044A (Edge Article) Chem. Sci., 2015, 6, 6097-6101

④Ariana Remmel .TOWARDS BRIGHTER AND MORE PHOTOSTABLE FLUOROPHORES. Nature, 630, 258-260 (2024), doi: https://doi.org/10.1038/d41586-024-01591-7

⑤李迎春，分子發(fā)光分析熒光磷光，石河子大學(xué)藥學(xué)院.

⑥Pascal Poc ORCID logoa,et al,Interrogating surface versus intracellular transmembrane receptor populations using cell-impermeable SNAP-tag substrates, DOI: 10.1039/D0SC02794D (Edge Article) Chem. Sci., 2020, 11, 7871-7883